Для изучения морфологии микроорганизмов, деталей их структуры используют метод окраски их анилиновыми красителями. Исследуемый материал разводят изотоническим раствором хлорида натрия или бульоном, маленькую каплю размазывают тонким слоем на предметном стекле по площади диаметром 1 см и высушивают. Такой препарат называется мазком. Его фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии, или этиловым либо метиловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.

Большинство красителей, используемых в микробиологии, является солями двух типов. У кислых красителей ион, придающий окраску (хромофор), является кислотой и при окрашивании более интенсивно связывается с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки, например эозин. У основных красителей роль хромофора играет катион. Будучи основанием, он более интенсивно связывается с ядерными (кислыми) компонентами клетки, например метиленовый синий. Некоторые красители не образуют химических соединений, а просто растворяются или осаждаются на окружающем материале. В механизме окрашивания имеют значение как химические, так и физические процессы.

Для окрашивания бактерий чаще используют основные красители: метиловый синий, кристаллический фиолетовый, основной фуксин, тионин. Широко используют щелочной раствор метиленового синего — краситель Леффлера, позволяющий выявить многие детали формы и структуры микробов.

Однако для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование для окрашивания только одного красителя (простой способ окраски) бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания, удовлетворяющие различным требованиям.

Способ окраски по Граму позволяет дифференцировать сходные по форме и размерам бактерии, относящиеся к разным видам и родам. Мазок, приготовленный из исследуемого материала, окрашивают вначале кристаллическим фиолетовым в течение 1—2 мин, а затем раствором Люголя 1—2 мин. Все микроорганизмы, находящиеся в мазке, приобретают темно-фиолетовый цвет.
 
После этого мазок обрабатывают 96 % этиловым спиртом в течение 30 с— 1 мин, смывая остатки спирта водой. Под влиянием спирта одни бактерии обесцвечиваются, а другие сохраняют фиолетовую окраску, приданную Им комплексом красителя с йодом. Те виды микробов, которые сохраняют фиолетовую окраску, называют грамположительными, а обесцвечивающиеся — грамотрицательными. После дополнительной окраски фуксином последние окрашиваются в красный цвет. Необходимо помнить, что на результаты окраски по Граму часто влияют небольшие отклонения в условиях культивирования или в методике окраски. Старые культуры или отмирающие клетки грамположительных бактерий могут стать грамотрицательными. В кислой среде, как правило, все микробы грамотрицательны. По отношению к окраске по способу Грама все бактерии делятся на две группы: грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены и др.) и грамотрицательные (менингококки, гонококки, возбудители брюшного тифа, дизентерии и др.).

В механизме окраски по Граму имеют значение особенности химического состава микроорганизмов, различия в проницаемости клеточных стенок, наличие рибонуклеата магния у грамположительных бактерий. Между большинством грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют различия в чувствительности к сульфаниламидам, пенициллину и лизоциму.

Способ окраски по Цилю — Нильсену предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов — микобактерий туберкулеза и лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический состав, отличающийся высоким (до 30—40%) содержанием особых жироподобных веществ (воски). Предварительно фиксированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулезом окрашивают раствором карболового фуксина при дву- или троекратном подогревании до появления паров. Видимо, благодаря размягчению воска краска проникает в клетку и удерживается в ней даже при последующей обработке препарата 5% серной кислотой в течение 3—5 с; поэтому кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашенными в красный цвет. Остальные микробы обесцвечиваются под действием кислоты и при дополнительной окраске метиленовым синим становятся синими. Для окраски спор, которые при обычных методах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи. Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение через нее краски. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков. Споры можно окрасить по методу Циля—Нильсена (споры красные, вегетативное тело синее) или по Ожешко. Для этого на высушенный, но нефиксированный мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течение 1—2 мин до закипания. Остатки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксируют в пламени. Дальнейшую окраску производят по методу Циля — Нильсена.
 
Капсулы при обычных методах окраски остаются бесцветными. Это позволяет применять простые методы окраски для выявления капсул микроорганизмов в мазках из органов и тканевой жидкости. Например, при окраске метиленовым синим ткани и клетки бактерий окрашиваются в голубой цвет, а вокруг бактерий сохраняется бесцветная зона — капсула. Из специальных методов окраски применяют способ Бурри: на край стекла наносят каплю туши и каплю исследуемого материала, перемешивают их, делают мазок (так же как мазок крови), высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Фон препарата окрашен в темно-дымчатый цвет, тела микробов и их капсулы тушью не окрашиваются и остаются бесцветными — негативный способ окраски.

Негативный метод Г и не а сочетает окраску тушью и фуксином. Мазок окрашивают по способу Бурри, затем высушивают, фиксируют спиртом и докрашивают фуксином Циля. Фон препарата черный, капсула не окрашена, бактериальная клетка красная.

Зерна волютина, находящиеся в клетках возбудителей дифтерии, выявляют, применяя окраску по Нейссеру. Этот сложный метод окраски включает несколько этапов: окраску фиксированного на пламени горелки препарата уксуснокислым синим (1—2 мин), затем добавление на мазок нескольких капель раствора Люголя на 1 мин и промывание водой. Препарат докрашивают раствором хризоидина или везувина в течение 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Зерна волютина окрашиваются в синий цвет, микробные клетки —в светло-коричневый. Методы окраски жгутиков — осаждение на них танина, который действует как протрава, т. е. способствует фиксации красителя на окрашиваемом объекте (метод Лейфсона).

Для окраски простейших, а также спирохет и риккетсий широко применяют способ Романовского — Гимзы. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением ее растворяют дистиллированной или водопроводной водой (рН 7,0—7,2) из расчета 1 : 10. Препарат фиксируют этиловым или хметиловым спиртом в течение 5—15 мин, окрашивают 30—40 мин, высушивают и микроскопируют. Ядро простейших, жгутики и блефа- ропласт окрашиваются в ярко-красный цвет, цитоплазма— в голубой, спирохеты и риккетсии — в сиреневато - синий или розовый.

Присутствие ДНК в клетках микроорганизмов можно определить с помощью реакции Фельгена и ее модификаций. Данный метод основан на способности ядерного материала окрашиваться в темно-пурпурный цвет при обработке реактивом Шиффа, (фуксин, обесцвеченный сернистой кислотой). Предварительно фиксированный мазок обрабатывают горячим (60°С) 1 н. раствором хлористоводородной кислоты в течение 7— 8 мин для разрушения (гидролиз) РНК, наличие которой, особенно в бактериях, затрудняет выявление ДНК. Можно также разрушить РНК специальным ферментом рибонуклеазой, а для окраски использовать красители, предложенные Романовским (азур I—II и эозин).


Практические занятия медицинские биологические препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний

Занятие 1-е. Вакцины и анатоксины.

Вопросы для обсуждения. 1. Искусственный иммунитет, активный и пассивный. 2. Препараты для создания искусственного активного иммунитета: вакцины и анатоксины. 3. Виды вакцин: живые, убитые и химические. 4. Способы приготовления вакцин. 5. Анатоксины нативные и очищенные, их получение и титрован...


Практические занятия вирусы

Занятие 1-е. Методы вирусологических исследований.

Вопросы для обсуждения: 1. Особенности биологии вирусов. 2. Принципы классификации вирусов. 3. Вирион, его строение, размеры и химический состав. 4. Микроскопические методы изучения морфологии вирусов. 5. Методы культивирования вирусов на культурах клеток, куриных эмбрионах, лаб...


Препараты для профилактики и лечения вирусных заболеваний

Препараты для профилактики и лечения оспы. Оспенная вакцина сухая — Vaccinum variolae siccum является живой вакциной. В зависимости от субстрата, на котором культивируют вирус, различают дермальную (культивирование на коже животных), тканевую (культивирование в клеточных культурах) и яичную или ововакцину (культивирование на куриных эмбрионах).

Возбудители основных вирусных заболеваний

Возбудитель оспы. Возбудитель оспы является одним из самых крупных вирусов (200—350 нм). Этот вирус может быть обнаружен в оптическом микроскопе при применении специальных методов окраски (тельца Пашена).

При натуральной оспе в эпителиальных клетках обнаруживаются внутриклеточные включения — тельца Гуарниери.



Приспособления для поддержания численности вида

Все обитающие на земле виды животных и растений истребляются в огромном количестве. Вследствие этого естественный отбор должен был создать и создал многочисленные приспособления для защиты видов от полного истребления.

Одним из основных способов защиты вида от истребления является большая прогрессия размножения. Чем в большей степени подвергается истреблению тот...


Природа препятствий, задерживающих размножение по Дарвину

Дарвин подробно останавливается на природе препятствий, задерживающих размножение. При объективном рассмотрении его данных видно, что истребление организмов так велико, что перенаселенности внутри вида в природе, как правило, не бывает.


Взаимоотношения, определяющие отбор по Дарвину

Естественный отбор способен творить новые формы только при условии размножения. Дарвин говорит, что все существующие на земле виды растений и животных обладают геометрической прогрессией размножения, тем не менее большинство видов в течение длительного времени сохраняет свою среднюю численность.

Следовательно, огромное количество особей погибает, не достигнув п...


Естественный и половой отбор по Дарвину

По аналогии с образованием пород домашних животных Дарвин считает, что в естественных условиях должно существовать какое-то начало, управляющее накоплением изменений в последующем ряду поколений, приводящее к расхождению признаков и образованию новых форм. Естественный отбор был открыт Дарвином и обоснован на принципах искусственного отбора. Открытию Дарвином в природе процесса, аналогичного селекционной практике человека, способствов...



Развитие зобной железы

Зобная железа (gl. thymus) закладывается у человека рано — у эмбриона длиной в 3 мм — в виде небольшого утолщения эпителия главным образом третьего жаберного кармана. По мере развития органа эпителий из компактного становится сетчатым, образуя reticulum. Петли этой эпителиальной ретикулярной ткани некоторое время совершенно свободны от каких-либо клеточных включений, и только у эмбриона длиной в 30—40 мм в них начина...


Развитие лимфатических желез и лимфоцитов

Закладкой лимфатических желез является [Кларк (Clark), Сабин] образование лимфатического синуса около больших вен (яремная, полая вена и др.). Формирование его очень легко проследить на шее, на уровне щитовидной железы. У эмбриона человека длиной в 4,5—5 см получается сначала небольшое, а затем все более увеличивающееся дивертикулообразное выпячивание эндотелия яремной вены. Таким образом, получается сосуд (лимфатический синус),...


Развитие эозинофильных и базофильных лейкоцитов

Таким образом, мы познакомились с циклом развития нейтрофильного лейкоцита из миэлобласта. Из миэлобласта также диференцируются эозинофильные и базофильные лейкоциты.

Салтыков, Николаев и некоторые другие авторы еще до сих пор придерживаются тог...


Развитие нейтрофильных лейкоцитов

Приблизительно во второй половине первого месяца у эмбриона человека в крови обнаруживаются совершенно другого вида клетки — миэлобласты (Негели); это — большие клетки (рис. 12) с большим круглым светлым ядром, с нежной сеткой базихроматина, почти совсем без диференцированного оксихроматина, чем они резко выделяются среди эритроблаетов; в ядре имеется несколько ядрышек; протоплазма голубая, так как всякая молодая клетка со...