Микоплазмы обычно культивируют на плотных питательных средах, содержащих сыворотку. Для некоторых из них разработаны методы культивирования на жидких питательных средах. Питательные среды должны обладать высокой осмотической концентрацией. Микоплазмы растут также на живых куриных эмбрионах и на средах, содержащих вместо сыворотки водные экстракты мелко измельченных куриных эмбрионов. Микоплазмы на плотных питательных средах образуют колонии с уплотненным врастающим центром и нежным ажурным краем (рис. 22). Через 3—5 дней инкубации при 37°С они могут достигать размера 1,5—2 мм, но обычно колонии настолько малы, что их трудно увидеть невооруженным глазом. На жидкие среды производят пересевы, вырезая кусочки агара с соответствующей колонией. В жидкой среде микоплазмы дают равномерное помутнение.
L-формы культивируют на средах, пригодных для роста бактерий, из которых произошли эти формы. Если происхождение L-форм неизвестно, используют богатый питательными веществами 1—1,5% агар на мясной воде или триптическом переваре бычьего сердца, содержащий 20—25% сыворотки и 10% дрожжевого экстракта. Обычно к средам добавляют пенициллин. Некоторые L-формы сохраняют стабильность и при его отсутствии. L-формы при росте на плотных питательных средах образуют колонии двух типов, отличающиеся по величине и способности к реверсии, т. е. возвращению к исходной форме бактерий.