В настоящее время для культивирования риккетсий и вирусов используют три метода: культуру ткани, развивающийся куриный эмбрион и заражение восприимчивых животных.
Культура ткани — кусочек органа или отдельные клетки различных тканей (культура клеток), которые живут и размножаются вне организма в питательной среде. Ткани культивируют в стеклянной химически чистой стерильной посуде из нейтрального стекла. Культивирование вирусов и риккетсий можно проводить в растущих и переживающих тканях.
Культура переживающих тканей более пригодна для культивирования риккетсий в связи с тем, что обменные процессы в ней снижены. Для получения культуры переживающей ткани кусочек почки курицы или куриного эмбриона помещают в жидкую питательную среду сложного состава или на поверхность скошенного агара. Клетки ткани сохраняют жизнеспособность в течение месяца.
Культура растущих тканей чаще используется для размножения вирусов. По способу получения и культивирования растущих тканей различают плазменные и бесплазменные культуры.
Плазменные культуры тканей представляют собой кусочек ткани, прикрепленный к покровному стеклу или стенке чашки Карреля с помощью свернувшейся плазмы. Поверх нее наливают питательную среду, частой сменой которой поддерживают рост тканей. В среду обычно добавляют пенициллин и стрептомицин для подавления роста бактерий и индикатор — феноловый красный. Через 3—5 дней в среду вносят вирус, который размножается в клетках и вызывает дегенеративные изменения.
Бесплазменные культуры тканей могут быть однократно культивируемые и перевиваемые. Ткань, которую используют для получения этих культур, предварительно обрабатывают 0,3—0,35% раствором трипсина, и она распадается на отдельные клетки. Клетки отмывают от трипсина и помещают в питательные среды сложного состава: солевой раствор Хенкса, 0,5% раствор гидролизата лактальбумина, синтетическую среду 199, к которым добавляют 10% бычьей сыворотки. Трипсинизированные культуры тканей выращивают обычно в виде слоя на поверхности покровных стекол, стенках чашек или пробирок. Тогда их называют однослойными культурами тканей, или культурами клеток.
Однократно культивируемые культуры клеток получают, трипсинизируя чаще всего ткани куриного эмбриона или его оболочек и почки обезьян. Эти культуры клеток используют однократно, например для получения вакцинных штаммов вируса полиомиелита.
Перевиваемые культуры клеток поддерживают в лабораториях десятками лет. Это могут быть культуры нормальных клеток эмбриона человека или животных, например клетки сердца обезьяны циномольгус (СОЦ). В других случаях это опухолевые клетки, поддерживаемые в питательных средах сложного состава, например культура тканей НeLa, Нер-1, Нер-2.
О размножении вируса в культуре клеток узнают по дегенеративным изменениям в них (цитопатическое действие вируса) и по отторжению пласта клеток. На месте гибели клеток образуются «стерильные пятна». Если гибель культуры клеток не наступила и они продолжают развиваться, выделяя кислые продукты обмена, цвет среды культивирования становится из светло-розового красным (положительная цветная проба). Изменения цвета среды достигают добавлением к ней индикатора — фенолового красного, который в кислой среде краснеет. Положительная цветная проба свидетельствует об отсутствии размножения вируса.
Культуры тканей и культуры клеток очень удобны для выделения и идентификации вирусов и наиболее часто используются для этих целей.
Куриный эмбрион 5—12-дневный используют для выявления вируса в исследуемом материале и получения больших количеств его. При заражении куриного эмбриона необходимо строго соблюдать правила асептики: обеззараживание воздуха, предметов в боксе с помощью бактерицидных ламп, ношение персоналом специальной стерильной одежды: халаты, маски, тапочки. Вскрытие яйца производят в стерильных условиях стерильными инструментами. Предварительно определяют положение воздушного мешка и над ним просверливают отверстие, вскрывая скорлупу. При заражении материалом, содержащим вирус, непосредственно в амниотическую или аллантоисную полость, в желточный мешок или ткань самого эмбриона, расположение которых определяют в овоскопе, можно ограничиться только небольшим отверстием в скорлупе яйца, через которое вводят иглу шприца. При заражении хорионаллантоисной оболочки материал можно ввести с помощью петли или капельницы, осторожно сняв лоскут скорлупы. Образовавшееся отверстие закрывают стерильным покровным стеклом, залив края его жидким парафином. После заражения яйцо помещают в термостат. К исследуемому материалу (слюна или испражнения) добавляют небольшое количество антибактериальных антибиотиков: пенициллина и стрептомицина. Вирус можно выявить в жидкостях и оболочках эмбриона; на последних можно обнаружить фокусные поражения.
Экспериментальные животные используются для вы-деления риккетсий и вирусов из исследуемого материала, а также для получения больших количеств этих микроорганизмов. Например, риккетсий можно культивировать в легких мышей и кроликов, производя заражение животных через нос. При этом способе культивирования получают большое количество материала и используют его для приготовления вакцин или диагностических препаратов. Успех выделения вируса зависит от правильного выбора вида экспериментального животного и способа введения материала. Для выделения, нейровирусов наилучшим является введение исследуемого материала в головной или спинной мозг, респираторных вирусов — на слизистую оболочку верхних дыхательных путей. Для лабораторных целей используют белых мышей, кроликов, белых и хлопковых крыс, морских свинок, обезьян. Наиболее широко применяют в вирусологической практике белых мышей, например для выделения вирусов — возбудителей бешенства, энцефалита, орнитоза. После введения исследуемого материала за животным устанавливают наблюдение, отмечают его поведение, появление симптомов заболевания, температуру. Если у первично зараженного животного отсутствуют клинические проявления болезни, производят 2—3 последовательных «слепых пассажа» на новой партии животных, вводя им суспензии из органов животных первой партии. При отсутствии симптомов заболевания у повторно зараженных животных результаты исследования считают отрицательными. При наличии у животных клинических признаков болезни производят определение вирусов в суспензии органов с помощью серологических реакций (реакция нейтрализации с известными сыворотками).
При наличии симптомов заболевания или гибели животного вскрывают его стерильными инструментами, соблюдая правила асептики. Рекомендуется вскрывать животное в агональном состоянии, усыпив его эфиром, или тотчас после наступления смерти. Труп животного кладут брюшком кверху на деревянную доску или пластину застывшего парафина, конечности фиксируют булавками, поверхность тела дезинфицируют 5% раствором карболовой кислоты или спиртом. Процесс вскрытия идет в определенной последовательности. Вначале исследуют наружные покровы, затем подкожную клетчатку и лимфатические узлы, органы грудной и брюшной полостей (после их вскрытия).
Для бактериологического исследования берут стерильно кровь из сердца, кусочки органов для посева на питательные среды, готовят мазки-отпечатки для окраски и микроскопирования.
Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа экспериментального животного, фиксируют в протоколах вскрытия и журналах бактериологического исследования.
