Сложные методы окраски (рис.) применяются для выявления некоторых структурных элементов микробной клетки, для окраски бактерий, не поддающихся окраске простыми методами, для дифференциально-диагностических целей. К наиболее широко применяемым методам сложной окраски относятся методы Грама, Циля — Нильсена, Гипса, Нейссера, Ожешки, Романовского — Гимзы.
 

Окраска по методу Грама. Метод Грама дает возможность разделить все бактерии на две группы — грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии после окраски генцианом фиолетовым (или кристаллическим фиолетовым, а также метиловым фиолетовым) и обработки йодом не обесцвечиваются этиловым спиртом, тогда как грамотрицательные при этих же условиях обесцвечиваются и должны быть дополнительно окрашены водным фуксином. Метод Грама имеет большое дифференциально-диагностическое значение и поэтому широко используется в микробиологической практике.

Способность бактерий различно окрашиваться по методу Грама обусловлена различиями структуры и химического состава бактериальной клетки.
 

Окраска по Граму заключается в следующем: фиксированный препарат окрашивают генцианом фиолетовым, раствор которого наливают на кусочек фильтровальной бумаги, положенный на мазок (краска дает осадки). Через 2—3 мин бумажку снимают, сливают краситель и на поверхность мазка наливают раствор Люголя на 1 мин, после чего препарат обесцвечивают этиловым спиртом, наливая его на поверхность препарата или погружая в стаканчик со спиртом. После промывания водой производят докрашивание водным фуксином в течение 1—2 мин. Окрашенный препарат промывают, подсушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
 

И. И. Синев предложил модификацию метода Грама, которая заключается в следующем: раствором генциана фиолетового пропитывают кусочки фильтровальной бумаги, которые могут длительно сохраняться в сухом, виде.

При окраске такой кусочек накладывают на фиксированный препарат и смачивают его несколькими каплями воды.

В дальнейшем окраску проводят по вышеописанной методике. Модификация Синева нашла широкое применение на практике.
 

Примерами грамположительных бактерий являются стафилококки, стрептококки, антракоиды. Относятся отрицательно к окраске по Граму кишечная и брюшнотифозная палочки, гонококки, менингококки.
 

Для изучения метода Грама студенты готовят смешанный препарат из культур стафилококка и кишечной палочки. На предметное стекло рядом наносят две небольшие капли воды. В одной из капель приготовляют взвесь из агаровой культуры стафилококка (грамположительный микроб), в другой — кишечной палочки (грамотрицательный микроб). Обе капли тщательно смешивают и приготовляют мазок. После подсушивания и фиксации на пламени горелки препарат окрашивают по методу Грама. Если окраска проведена правильно, то стафилококк должен быть окрашен в фиолетовый цвет, а кишечная палочка — в розовый.
 

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля — Нильсена. Бактерии, содержащие большое количество жиро- и воскоподобных веществ (микобактерии туберкулеза), не могут быть окрашены простыми методами. Для окраски этих бактерий необходимо применять концентрированные растворы красителей, содержащие протравы (фенол), и вести окрашивание при подогревании. Метод Циля — Нильсена состоит в следующем: на поверхность фиксированного препарата накладывают кусочек фильтровальной бумаги, на который наливают несколько капель карболового фуксина Циля. Предметное стекло берут пинцетом Корнэ и осторожно подогревают над пламенем горелки до появления паров, дают остыть и затем повторяют подогревание 2— 3 раза. Если краска при подогревании подсыхает, то ее необходимо добавлять. После остывания препарата снимают фильтровальную бумагу и обесцвечивают препарат, погружая его в стаканчик с 5% раствором серной кислоты. После тщательного промывания препарат докрашивают метиленовым синим по Леффлеру.
 

При окраске по методу Циля — Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, а остальные после обесцвечивания кислотой докрашиваются метиленовым синим.
 

Для окраски кислотоустойчивых бактерий по методу Циля — Нильсена студенты получают готовые фиксированные мазки из мокроты больного туберкулезом. Препараты из мокроты готовят следующим образом: мокроту наливают в чашку Петри и из нее выбирают гнойный комочек при помощи пинцета, который помещают на предметное стекло. Вторым предметным стеклом раздавливают этот комочек между двумя стеклами. Таким образом получают два мазка мокроты, покрывающих ²/₃ предметного стекла. Препараты после подсушивания и фиксации окрашивают по методу Циля — Нильсена.
 

При микроскопии препаратов мокроты больного туберкулезом, окрашенных по методу Циля — Нильсена, следует искать мелкие, иногда зернистые, красные микобактерии туберкулеза, расположенные одиночно или в виде небольших скоплений на синем фоне.
 

Окраска спор по методу Ожешки. В связи с особенностями структуры и химического состава спор они не могут быть окрашены обычными методами. Перед окраской необходимо протравить оболочку споры действием кислоты при подогревании, а затем окрашивать препарат по методу Циля — Нильсена.
 

Метод окраски спор по Ожешке состоит в следующем: из культуры спорообразующих бактерий (антракоид, сенная палочка) приготовляют небольшой довольно толстый мазок на одном из концов предметного стекла. Мазок подсушивают, но не фиксируют. На мазок наливают несколько капель 1% раствора соляной кислоты и осторожно подогревают до появления паров на пламени горелки 2—3 раза, после чего кислоту сливают и осторожно промывают препарат водой (препарат нефиксированный!), затем подсушивают, фиксируют и окрашивают по методу Циля — Нильсена. Споры бактерий с большим трудом прокрашиваются, но после окрашивания не обесцвечиваются кислотой. Вегетативные формы после обесцвечивания дополнительно докрашиваются метиленовым синим.
 

Студенты готовят препараты из культур антракоида и окрашивают их по методу Ожешки. Для изучения различных форм и различной локализации спор студенты микроскопируют и зарисовывают препараты из культур столбнячной палочки и возбудителей газовой гангрены, окрашенных фуксином или по методу Грама. При этих методах окраски спора остается непрокрашенной и обнаруживается в виде овальных или круглых бесцветных образований внутри окрашенной цитоплазмы клетки.
 

Негативный метод Бурри. Каплю культуры или другого материала (например, зубной налет) смешивают с каплей туши и из этой смеси приготовляют препарат по типу мазка крови. Этим методом студенты пользуются при изучении микрофлоры зубного налета, для обнаружения в нем спирохет.
 

Выявление капсул по методу Гинса. Капсула не выявляется при применении обычных методов окраски, так как составляющие ее слизистые вещества не обладают окрашиваемостью. Окраска по методу Гинса состоит из двух этапов. Каплю исследуемой культуры помещают на краю стекла, тщательно смешивают с каплей туши, после чего приготовляют мазок по типу мазка крови. Препарат подсушивают, фиксируют на пламени горелки и докрашивают в течение 2—3 мин фуксином (фуксин Циля, разведенный 1 :2 или 1:3). Окрашенный мазок промывают и подсушивают. Тушью создают темный фон препарата, на котором хорошо видны бесцветные капсулы вокруг окрашенных фуксином бактерий.
 

Для изучения капсул студенты готовят препарат из культуры бактерий Фридлендера и окрашивают его по методу Гинса. Следует обратить внимание на слизистый характер роста этого микроба, что обусловлено консистенцией капсул.
 

Окраска зерен волютина по методу Нейссера. Зерна волютина обладают метахромазией, т.е. относятся к красителям иначе, чем цитоплазма клетки, и поэтому могут быть легко выявлены при применении специальных методов окраски. При окраске по методу Нейссера фиксированный препарат в течение 1—2 мин окрашивают метиленовым синим по Нейссеру, после чего краситель сливают и на препарат наносят несколько капель раствора Люголя на 1 мин. После промывания водой докрашивают везувином в течение 1—3 мин. При этом методе окраски зерна волютина окрашиваются в темно-синий, почти черный цвет, а цитоплазма — в желтый.
 

Студенты изучают зерна волютина на готовых препаратах коринебактерий дифтерии, окрашенных по методу Нейссера.
 

Окраска риккетсий по методу Здродовского представляет собой несколько видоизмененный метод Циля—Нильсена и состоит в следующем: карболовый фуксин Циля разводят из расчета 10—15 капель 5 мин, после чего обесцвечивают препарат 0,01% раствором соляной кислоты в течение 1—3 с. После промывания водой препарат докрашивают 1% раствором метиленового синего. Риккетсии, в связи с наличием в их цитоплазме значительного количества липидов, сохраняют окраску фуксином, в то время как клетки, в которых паразитируют риккетсии, обесцвечиваются кислотой и дополнительно окрашиваются в синий цвет.
 

На занятиях демонстрируются риккетсии Провачека, окрашенные по методу Здродовского или Романовского— Гимзы.
 

Окраска по методу Романовского — Гимзы. Краситель Романовского — Гимзы состоит из азура, эозина и метиленового синего. Краситель перед употреблением разводят нейтральной дистиллированной водой из расчета одна капля красителя на 10 мл дистиллированной воды. Краситель наливают на препарат, предварительно фиксированный жидким фиксатором, на 1 ч, после чего препарат промывают водой и высушивают. При этом методе окраски ядра клеток окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма в голубой. Методом Романовского — Гимзы широко пользуются для окраски спирохет, простейших, риккетсий. Спирохеты в зависимости от их химического состава (содержания нуклеопротеидов) окрашиваются в сине-фиолетовый или розовый цвет.
 

Студенты изучают морфологию спирохет возвратного тифа, лейшманий (лептомонадную и лейшманиальную формы) и возбудителя малярии на мазках, окрашенных по методу Романовского — Гимзы.

При микроскопии лейшманий (см. рис.) следует обратить внимание на структуру микроба, разницу в размерах жгутиковой и безжгутиковой форм, на внутриклеточную локализацию лейшманий в мазке из язвы.

При микроскопии мазка из крови больного малярией изучить различные стадии шизогонии и гаметоциты (рис.).

Практические занятия медицинские биологические препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний Занятие 1-е. Вакцины и анатоксины. Вопросы для обсуждения. 1. Искусственный иммунитет, активный и пассивный. 2. Препараты для создания искусственного активного иммунитета: вакцины и анатоксины. 3. Виды вакцин: живые, убитые и химические. 4. Способы приготовления вакцин. 5. Анатоксины нативные и очищенные, их получение и титрован... Читать далее...