Реакциями иммунитета называют феномены, которые можно наблюдать при взаимодействии антигена с антителом. Все реакции иммунитета характеризуются большой чувствительностью и специфичностью, что позволяет ими широко пользоваться при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.
Реакция между антигеном и антителом может проявляться в форме лизиса (растворения) бактериальных или других клеток, например эритроцитов. Эта реакция в отличие от предыдущих происходит только при участии трех компонентов — антигена, антитела и комплемента. Комплемент, содержащийся в любой свежеполученной сыворотке, в отличие от антител лишен специфичности. В качестве комплемента обычно пользуются свежеполученной сывороткой морской свинки или сухим консервированным комплементом. Комплекс антиген + антитело обладает высокими адсорбционными свойствами и поэтому при наличии в среде этого комплекса на нем адсорбируется комплемент. На этом свойстве комплемента основана весьма чувствительная реакция, называемая реакцией связывания комплемента. Реакция агглютинации. Реакцией агглютинации называют склеивание бактериальных или других клеток под влиянием иммунной сыворотки. Эта реакция происходит только в присутствии электролитов и проявляется в образовании видимых невооруженным глазом зерен или хлопьев. У безжгутиковых бактерий, имеющих только соматический О-антиген, происходит склеивание самих микробных клеток и агглютинация имеет тонкозернистый характер. Эта форма агглютинации (О-агглютинация) протекает медленно, в течение 18—24 ч при температуре 37°С. При наличии у бактерий жгутикового Н-антигена клетки склеиваются жгутиками, при этом образуются крупные рыхлые хлопья и реакция протекает значительно быстрее — в течение 2 ч при температуре 37°С. Ингредиентами для реакции агглютинации являются: 1) антиген в виде взвеси живых или убитых (диагностикум) микробных клеток; 2) антитела — агглютинины в сыворотке больного или полученные путем искусственной иммунизации животных соответствующим антигеном; 3) электролит в виде изотонического раствора хлорида натрия, которым пользуются для разведения сыворотки и антигена. Существует несколько методов постановки реакции агглютинации. Наиболее распространенными методами являются: развернутая реакция агглютинации, которая ставится в пробирках с различными разведениями сыворотки, реакция агглютинации на стекле и реакция непрямой гемагглютинации (РИГА). Реакция непрямой гемагглютинации является очень чувствительной и в последнее время находит все более широкое применение в диагностике инфекционных заболеваний. Реакцией агглютинации пользуются в диагностике инфекционных заболеваний в двух направлениях: а) для определения вида микроба, выделенного от больного или из внешней среды; б) для обнаружения антител в сыворотке больного или реконвалесцента. В первом случае неизвестный микроб (антиген) определяют по известному антителу. Положительный результат реакции укажет на то, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления иммунной сыворотки. Так, например, если культура, выделенная от больного с подозрением на брюшной тиф, дает положительную реакцию агглютинации с диагностической агглютинирующей брюшнотифозной сывороткой — выделенный микроб является брюшнотифозной палочкой. Для обнаружения антител в сыворотках больных (брюшной тиф, бруцеллез, сыпной тиф и др.), которые появляются в результате развития инфекционного процесса, необходимо располагать известными антигенами в виде взвеси живой культуры, или диагностикума. Например, для диагностики брюшного тифа широко пользуются реакцией Видаля, для постановки которой у больного с подозрением на брюшной тиф берут кровь и с полученной сывороткой ставят реакцию агглютинации с брюшнотифозным диагностикумом. Положительная реакция укажет на наличие в исследуемой сыворотке антител к возбудителю брюшного тифа. Для постановки диагностических реакций агглютинации выпускают специальные препараты — диагностические агглютинирующие сыворотки и диагностикумы. Диагностикумы (антигены) представляют собой взвесь убитых бактерий определенного вида. Например, брюшнотифозный диагностикум — это взвесь убитых брюшно-тифозных бактерий, сыпнотифозный — взвесь убитых риккетсий Провачека и т. д. При лабораторной диагностике некоторых инфекционных заболеваний (например, брюшной тиф) имеет значение раздельное определение О- и Н-антител в исследуемых сыворотках, так как время их появления у больных и сохранения у реконвалесцентов различно. Для этих исследований необходимо располагать соответственно О- и Н-диагностикумами. Исходя из различий их химического состава (О-антиген — полисахаридо-полипептидо-липоидный комплекс, Н-антиген — белок) О-антиген получают путем воздействия на микробную взвесь высокой температуры (100°С в течение 11/2 — 2 ч) или этилового спирта, которые разрушают термолабильный Н-антиген, полностью сохраняя термостабильный О-антиген. Н-антиген получают путем инактивирования микробной взвеси формалином. Диагностические сыворотки готовят путем иммунизации животных (кролики, лошади и др.) соответствующими антигенами. Полученные от иммунизированных животных сыворотки (нативные) титруют. Титром агглютинирующей сыворотки считается наибольшее ее разведение, дающее реакцию агглютинации. К приготовленной сыворотке прибавляют консервант и в стерильных условиях разливают в ампулы. Сыворотки выпускают в жидком и сухом виде. Нативная (неадсорбированная) сыворотка содержит антитела к антигенам микроба, который был использован для иммунизации, но она может давать реакцию и с родственными видами за счет наличия в ней групповых антител. Поэтому неадсорбированные сыворотки применяют только для постановки развернутой реакции агглютинации, где принимается во внимание не только наличие реакции, но учитывается ее титр (групповая реакция возможна лишь при малом разведении сыворотки). Реакция агглютинации на предметном стекле, поставленная с неадсорбированной сывороткой, должна расцениваться только как ориентировочная. В настоящее время пользуются адсорбированными сыворотками, полученными из нативных путем адсорбции групповых антител по методу Кастеллани. При насыщении нативной сыворотки гомологичными бактериями адсорбируются как специфические, так и групповые антитела. Если же для адсорбции применяют родственные гетерогенные бактерии, то из сыворотки удаляются только групповые антитела, а специфические полностью сохраняются. Адсорбированные сыворотки могут быть монорецепторными, то есть содержащими антитела только к одному антигенному рецептору, и поливалентными, содержащими антитела к нескольким определенным рецепторам. Используют адсорбированные сыворотки в реакции агглютинации на стекле. На практических занятиях студенты ставят развернутую реакцию агглютинации. В зависимости от цели исследования иммунную сыворотку разводят по-разному. Диагностические агглютинирующие сыворотки, полученные путем гипериммунизации животных, как правило, имеют очень высокий титр (1:10 000 — 1:20 000 и выше). Титром, указанным на этикетке ампулы, и руководствуются при приготовлении разведений для реакции агглютинации. В сыворотках больных титр антител не бывает высоким (1 :400 — 1: 1000), поэтому ограничиваются более низкими разведениями этих сывороток. Из иммунной сыворотки готовят сначала основное или рабочее разведение сыворотки (1:50, 1:100 или 1:500), из которого получают дальнейшие двукратные разведения. В ряд пробирок разливают по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия, затем в первую пробирку вносят равный объем сыворотки в рабочем разведении и после перемешивания 0,5 мл переносят во вторую пробирку и т. д. В последнюю пробирку сыворотку не вносят — контрольная пробирка. Контроль ставят для исключения спонтанной агглютинации, которая может возникать при применении недоброкачественных диагностикумов или живых культур, находящихся в R-форме. Затем во все разведения и контрольную пробирку прибавляют по две капли диагностикума или микробной взвеси. После встряхивания штативы помещают на 2 ч в термостат при температуре 37°С, а затем выдерживают в течение суток при комнатной температуре. Н-агглютинацию учитывают через 2 ч невооруженным глазом или при помощи агглютиноскопа. Окончательный результат регистрируют на следующий день. При наличии агглютинации на дне пробирки появляется хлопьевидный (Н-агглютинация) или зернистый (О-агглютинация) осадок. Степень реакции оценивается крестами. В связи с ограниченностью времени одни студенты ставят реакцию агглютинации с диагностической сывороткой (брюшнотифозной), определяя ее титр. В качестве антигена используется брюшнотифозный диагностикум. Другие студенты ставят реакцию агглютинации с сывороткой, полученной от больного (табл.).
Реакцию агглютинации на стекле ставят с небольшими разведениями сыворотки (1:10, 1: 20). В капле разведенной сыворотки растирают петлей небольшое количество суточной агаровой культуры или вносят каплю бульонной культуры. При постановке реакции агглютинации на стекле следует ставить контроль — антиген + изотонический раствор хлорида натрия. Учет результатов производят через несколько минут. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации. Гемагглютинацией называют феномен склеивания эритроцитов (агглютинацию) под влиянием соответствующих антител — гемагглютининов. Помимо этого, гемагглютинацию могут вызывать некоторые вирусы, однако вирусная гемагглютинация не является серологической реакцией (рис.). Реакция непрямой гемагглютинации является серологической реакцией, которая в настоящее время широко используется в лабораторной практике для определения природы антител и их титра в сыворотках больных. Механизм РИГА заключается в следующем: эритроциты, обработанные различными антигенами, приобретают способность агглютинироваться соответствующими антителами. РИГА ставят либо в агглютинационных пробирках, либо на специальных плексигласовых пластинках с лунками. Сыворотку больного разводят обычным способом и по 0,5 мл разливают в лунки, после чего во все лунки добавляют по 0,5 мл эритроцитарного диагностикума [бактериальные антигены, адсорбированные на эритроцитах человека (О)-группы или животных, обработанных таннином]. Эритроцитарные диагностикумы для РИГА изготовляются производственными институтами. Результаты реакции оценивают через 2 ч пребывания ее в термостате при 37°С и через 24 ч нахождения при комнатной температуре. Положительная реакция характеризуется образованием осадка с неровными краями, покрывающего почти все дно лунки («зонтик»), отрицательная — компактным осадком с ровными краями («пуговка») (табл. ). Если РИГА используют для выявления антигена, то пользуются эритроцитарным диагностикумом, сенсибилизированным определенными антителами. Одной из разновидностей реакции агглютинации является реакция Кумбса, которая используется для обнаружения неполных антител. Неполные антитела, обладая способностью соединяться с антигеном (эритроциты, бактерии), не вызывают видимых реакций. Реакция Кумбса протекает в два этапа. На первом этапе реакции антиген (микробная взвесь, эритроциты) приводят в контакт с сывороткой, которую исследуют на наличие неполных антител. На втором этапе к сенсибилизированному неполными антителами антигену добавляют антиглобулиновую сыворотку (сыворотка кролика, иммунизированного глобулинами сыворотки человека). Антитела этой сыворотки, взаимодействуя с глобулинами неполных антител, вызывают видимую реакцию агглютинации. Реакцию Кумбса используют как для обнаружения неполных антибактериальных антител в сыворотках больных, так и для выявления неполных антител к форменным элементам- крови. Реакция преципитации. По своей сущности реакция преципитации аналогична реакции агглютинации. При реакции преципитации происходит образование преципитата (помутнение, осадок) при взаимодействии антитела с антигеном, который берется в виде коллоидного раствора. Для постановки реакции преципитации может быть использован как полноценный антиген, так и гаптен. Реакция преципитации обладает высокой специфичностью и чувствительностью и позволяет обнаруживать антиген в ничтожно малых количествах (1 : 100 000). Реакция преципитации нашла широкое применение в судебно-медицинской практике для определения видовой принадлежности крови. В микробиологической практике она имеет более ограниченное применение, чем реакция агглютинации, так как является более сложной. В качестве примера использования реакции преципитации в диагностике инфекционных заболеваний может быть приведена реакция Асколи, которой пользуются для определения зараженности сибиреязвенной палочкой продуктов животного происхождения (загнившие трупы, животное сырье — кожа, шкуры и др.). Из исследуемого материала путем кипячения извлекают антиген, который используют для постановки реакции преципитации с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой. Реакцией преципитации можно пользоваться при лабораторной диагностике чумы, цереброспинального менингита и др. Наиболее чувствительным методом является кольце- преципитация, при постановке которой разведения антигена наслаивают на преципитирующую сыворотку, разлитую в специальные узкие (преципитационные) пробирки. В настоящее время нашла широкое применение реакция преципитации в геле. Диагностическую преципитирующую сыворотку, так же как и агглютинирующую, приготовляют путем иммунизации животных соответствующими антигенами. Титр преципитирующих сывороток указывает на способность сыворотки давать положительную реакцию с указанным разведением антигена. Так, например, сыворотка с титром 1:10 000 дает положительную реакцию преципитации с антигеном, взятым в разведении 1 : 10 000. На практических занятиях студенты ставят реакцию кольцепреципитации. В преципитационные пробирки наливают 0,5 мл преципитирующей сыворотки (например, против белка человека), а затем осторожно при помощи пастеровской пипетки наслаивают соответствующий антиген (сыворотка человека) в разведении 1 : 1000 и более. Оба ингредиента должны быть абсолютно прозрачными. При положительной реакции сразу или в течение 5 мин на границе обеих жидкостей образуется помутнение в виде кольца. Реакцию преципитации следует рассматривать на темном фоне (табл.). Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой диффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной диффузии, когда антиген и антитело диффундируют навстречу друг друга в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации. В зависимости от сложности системы антиген — антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, используемая для определения токсигенности дифтерийных бактерий. Реакция лизиса. Специфические антитела, вызывающие лизис (растворение) клеток, называют лизинами. Различают бактериолизины, гемолизины и др. Лизирующее действие антитела на соответствующие клетки проявляется только в присутствии комплемента. Комплемент является составной частью крови каждого человека и животного, он обладает малой стойкостью, разрушается при хранении, нагревании сыворотки при температуре 56°С и при воздействии различных физических и химических факторов. Сыворотка, лишенная комплемента, называется инактивированной. По своей природе комплемент является веществом белковой природы. Комплемент легко адсорбируется комплексом антиген+ + антитело. При бактериолизе бактериальная клетка (живая) теряет подвижность, набухает, а затем распадается на отдельные зерна и полностью растворяется. Реакцию лизиса можно ставить в пробирке (in vitro) или в организме животного (in vivo).
Для постановки реакции гемолиза нужны следующие ингредиенты: 1) антиген — 5% взвесь эритроцитов барана; 2) антитело — гемолитическая сыворотка (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана, инактивированная при температуре 56°С в течение 30 мин, разведенная до 1/3—2/3 титра); 3) комплемент — свежеполученная сыворотка морской свинки, разведенная в соотношении 1:10. Для постановки реакции гемолиза в штатив помещают 6 пробирок, в которые вносят два первых ингредиента и изотонический раствор хлорида натрия по приведенной схеме (табл.).
Штатив помещают в термостат при 37°С на 30 мин, после чего во все пробирки, кроме 5-й и 6-й, прибавляют комплемент в различных количествах. Каждая пробирка должна содержать одинаковый объем жидкости (2 мл), поэтому в пробирки следует добавить соответствующее количество изотонического раствора хлорида натрия. После добавления комплемента пробирки снова помещают в термостат на 30 мин и затем производят учет результатов. Гемолиз должен произойти в первых 2 — 3 пробирках. В контрольных пробирках один из ингредиентов отсутствует, поэтому гемолиз не должен произойти. Реакция связывания комплемента (РСК). Далеко не всегда при соединении антигена с антителом происходят видимые изменения (агглютинация, преципитация и пр.). В этих случаях о реакции между антигеном и антителом можно судить только косвенным путем по способности комплемента адсорбироваться на образовавшемся комплексе антиген + антитело. Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингредиенты: 1) антиген — микробная клетка или антиген, извлеченный из микробной клетки; 2) сыворотка больного или иммунизированного животного, инактивированная при температуре 56°С; 3) комплемент — свежеполученная сыворотка морской свинки или консервированный комплемент; 4) гемолитическая система, состоящая из гемолитической сыворотки (сыворотка кролика, иммунизированного эритроцитами барана) и 5% взвеси эритроцитов барана.
Реакция связывания комплемента является одной из наиболее чувствительных, но в то же время наиболее сложных реакций иммунитета. Она нашла широкое применение в диагностике сифилиса (реакция Вассермана), риккетсиозов и вирусных заболеваний. Схематически реакция связывания комплемента представлена на рис. Ингредиенты для постановки реакции связывания комплемента предварительно подвергают титрованию, исследуемую сыворотку инактивируют, из отмытых бараньих эритроцитов приготовляют 5% взвесь. Все ингредиенты после титрования разводят изотоническим раствором хлорида натрия до содержания рабочей дозы в 0,5 мл. Реакцию ставят в объеме 2,5 мл, для чего каждый ингредиент берут в объеме 0,5 мл. РСК ставят в две фазы. Пробирки, содержащие антиген, антитело и комплемент, помещают на один час в термостат, после чего в них добавляют по 1 мл гемолитической системы (взвесь эритроцитов барана и гемолитическая сыворотка), которая предварительно помещалась в термостат на 30 мин. Учет результатов производят после пребывания реакции в термостате в течение часа (табл.).
Реакция антиген — антитело может быть выявлена иммунофлюоресцентным методом. Этот метод в последнее время приобретает все большее и большее значение. Метод основан на использовании антител (иммуноглобулинов), меченных флюорохромами (например, изоцианат флюоресцеина), которые, образуя комплекс антиген+антитело, делают реакцию видимой в люминесцентном микроскопе. Метод является универсальным, с его помощью можно выявлять различные антигены — корпускулярные и растворимые, бактериальные и вирусные, антигены живых и убитых клеток. Быстрота получения результатов позволяет использовать этот метод для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.
Раздел: Практические занятия по микробиологии | Категория: Лабораторные занятия по микробиологии | ||
 Занятие 1-е. Методы вирусологических исследований. Вопросы для обсуждения: 1. Особенности биологии вирусов. 2. Принципы классификации вирусов. 3. Вирион, его строение, размеры и химический состав. 4. Микроскопические методы изучения морфологии вирусов. 5. Методы культивирования вирусов на культурах клеток, куриных эмбрионах, лаб... Читать далее... |
К реакциям иммунитета (серологическим реакциям) относятся реакция агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента и др. Каждая реакция иммунитета протекает в две фазы: первая фаза одинакова для всех реакций иммунитета — это взаимодействие антигена с антителом, в результате чего образуется комплекс антиген + антитело. Во второй фазе возникают видимые на глаз изменения, причем характер возникающих феноменов (агглютинация — склеивание, преципитация — осаждение и др.) зависит от условий среды, в которой происходит взаимодействие антигена с антителом, и от физико-химического состояния антигена. Так, если антиген берут в виде микробной взвеси, комплекс антиген + антитело легко осаждается электролитами и дает феномен агглютинации (склеивание бактериальных клеток с образованием видимых глазом хлопьев) или феномен преципитации, если антиген был взят в виде коллоидного раствора.
Реакция гемолиза состоит в том (рис. 15), что при взаимодействии гемолитической сыворотки (сыворотка животного, иммунизированного чужеродными эритроцитами) на эритроциты соответствующего вида животных в присутствии комплемента происходит их растворение — гемолиз. При этом мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость (лаковая кровь). Реакцию гемолиза используют в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.
При положительной реакции происходит адсорбция комплемента на образовавшемся комплексе антиген + антитело и связывание этим комплексом комплемента делает невозможным реакцию гемолиза. Таким образом, отрицательная реакция гемолиза свидетельствует о положительной реакции связывания комплемента. При отсутствии в исследуемой сыворотке антител (или несоответствии антитела антигену) не может образоваться комплекс антиген + антитело, комплемент остается свободным и вызывает лизис эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. Таким образом, положительная реакция гемолиза говорит об отрицательной реакции связывания комплемента (рис.).
