Приготовление мясопептонного бульона (МПБ). Первым этапом приготовления мясопептонного бульона является приготовление мясной воды. Из мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий приготовляют фарш. 1 кг фарша заливают 2 л водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Употребление (для приготовления мясной воды) водопроводной воды диктуется тем, что в водопроводной воде содержатся различные минеральные вещества в количествах, необходимых для жизнедеятельности бактерий. Настой отжимают через полотно или кипятят вместе с мясом в течение часа, после чего остужают, фильтруют до полной прозрачности, разливают в бутылки и стерилизуют в автоклаве.

Для приготовления мясопептонного бульона к мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия. Хлорид натрия имеет особое значение для жизнедеятельности бактерий, поэтому он всегда входит в состав питательных сред. Особое биологическое значение хлорида натрия состоит в том, что он создает условия изотонии, необходимые для нормального течения всех жизненных процессов в микробной клетке. Затем устанавливают необходимую реакцию (pH) питательной среды. После 30-минутного кипячения добавляют дистиллированную воду до первоначального объема и фильтруют бульон до полной прозрачности через бумажный фильтр, еще раз проверяют реакцию (pH), разливают бульон по пробиркам и колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С.

Для роста большинства бактерий оптимальной является слабощелочная реакция питательной среды (pH 7,2— 7,6). Ориентировочно реакцию питательной среды устанавливают, пользуясь лакмусовой бумажкой, которая при нанесении на нее капли питательной среды слабощелочной реакции должна слегка посинеть. Для окончательного, более точного определения концентрации водородных ионов (pH) следует пользоваться колориметрическим или электрометрическим методом.

Приготовление мясопептонного агара (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3,5% сухого агара. Количество добавляемого агара зависит от его качества и от необходимости приготовить более или менее плотную питательную среду. Сухой агар, получаемый из морских водорослей, представляет собой вещество, набухающее в воде и способное давать плотные студни. Агар плавится при температуре, близкой к 100°С, и застывает при температуре 40—50°С.

После прибавления к мясопептонному бульону необходимого количества сухого агара жидкость кипятят до полного растворения агара или растворяют агар в автоклаве при температуре 115—120°С. Мясопептонный агар фильтруют в горячем виде, проверяют реакцию, разливают по пробиркам и колбам и стерилизуют при температуре 120°С в течение 15—20 мин.

Для получения большей поверхности для культивирования бактерий приготовляют так называемый косой агар, для чего сразу после стерилизации пробирки укладывают на стол остывать в скошенном положении. После застывания агар отдает конденсационную воду, собирающуюся внизу пробирки. Наличие конденсационной воды указывает на свежесть и достаточную влажность агара.

Наиболее простой по химическому составу питательной средой является пептонная вода. Для приготовления этой среды 1% пептона и 0,5% хлорида натрия растворяют в дистиллированной воде. Среду фильтруют и стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С.

Из простых питательных сред (мясопептонный бульон и мясопептонный агар) можно приготовить ряд сложных сред.

Для роста некоторых бактерий необходимо наличие в питательной среде глюкозы. Сахарные питательные среды приготовляют из простых путем добавления к ним 1 % глюкозы. Сахарные среды стерилизуют дробным методом в аппарате Коха.

При приготовлении сывороточных сред к мясопептонному бульону или агару добавляют 10—20% стерильной сыворотки (бычья, лошадиная и др.). При приготовлении сывороточного агара мясопептонный агар предварительно расплавляют на кипящей водяной бане, а сыворотку добавляют к среде, остуженной до температуры 45—50°С. Сывороточные среды необходимо контролировать на стерильность. Для этого их помещают в термостат на 3 дня.

Некоторые патогенные бактерии могут расти только на среде, содержащей человеческий белок. Для культивирования этих микробов приготовляют асцит-агар и асцит-бульон. На 2—3 части мясопептонной среды добавляют одну часть асцитической жидкости. (Асцитической жидкостью называют серозную жидкость, которая скапливается в брюшной полости при заболеваниях сердца и некоторых других заболеваниях и которую удаляют с лечебными целями.)

Для приготовления кровяного агара стерильно взятую кровь (человека, кролика, барана или другого животного) прибавляют к стерильному расплавленному и остуженному до температуры 45°С мясопептонному агару. Стерильно взятую кровь или тотчас прибавляют в мясопептонный агар в количестве 5—20%, или подвергают дефибринированию. Дефибринированная кровь может в течение нескольких дней сохраняться в рефрижераторе. После добавления крови мясопептонный агар тщательно смешивается (избегать образования пузырьков) и разливается в стерильные чашки Петри или пробирки.

Все сложные питательные среды, содержащие животный белок (сыворотку или асцитическую жидкость) или кровь, необходимо готовить в строго стерильных условиях, так как их нельзя подвергать стерилизации.

Для выделения чистых культур некоторых бактерий применяют элективные или избирательные среды. В каждом отдельном случае состав элективной среды будет особым. В элективной среде должны быть созданы условия, благоприятные для размножения выделяемых бактерий и неблагоприятные для сопутствующей флоры. Так, например, для выделения холерного вибриона элективной средой является щелочная пептонная вода, для дифтерийной палочки — свернутая сыворотка, для тифопаратифозных бактерий — среды с добавлением желчи.

Дифференциально-диагностические среды позволяют изучить ферментативную активность и помогают в определении (идентификации) вида выделяемой культуры. Дифференциально-диагностическими средами пользуются главным образом при работе с бактериями кишечнотифозной группы (среды Эндо, Левина и др.).

Среда Эндо состоит из мясопептонного агара, лактозы (1%) и индикатора (1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного 10% водным раствором сульфита натрия на 100 мл среды). Среду разливают в стерильные чашки Петри и употребляют в день приготовления. Колонии кишечной палочки на среде Эндо имеют фуксиново-красный цвет, так как этот микроб ферментирует лактозу. При этом образуются альдегиды и кислоты, которые разрывают непрочную связь между; фуксином и сульфитом натрия и восстанавливают фуксин до первоначального (красного) цвета. Среда Левина состоит из мясопептонного агара, лактозы (1%) и индикатора (эозин и метиленовый синий). Среда имеет фиолетовый цвет, колонии кишечной палочки — темно-синий. 

В настоящее время в лабораторной практике широко пользуются как простыми, так и дифференциально-диагностическими сухими питательными средами, изготовляемыми промышленностью. Приготовление дифференциально-диагностических сред из сухого препарата сводится к следующему: навеску среды растворяют в дистиллированной воде и после 5-минутного кипячения разливают в стерильные чашки Петри.

На практических занятиях студенты получают одно из следующих заданий:

а) приготовить кровяной агар и разлить его по стерильным чашкам Петри,

б) приготовить среду Эндо (или Левина) из сухого препарата (3,5 г сухой среды всыпать в колбу, налить 50 мл дистиллированной воды, кипятить, помешивая, до полного растворения 10 мин) и затем разлить в стерильные чашки Петри;

в) приготовить чашки с мясопептонным агаром и косой агар. Колбы и пробирки с мясопептонным агаром поместить на водяную баню и кипятить до полного растворения. Пробирки поместить на подставку для скашивания, из колбы разлить агар по стерильным чашкам Петри.
 

Практические занятия медицинские биологические препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний Занятие 1-е. Вакцины и анатоксины. Вопросы для обсуждения. 1. Искусственный иммунитет, активный и пассивный. 2. Препараты для создания искусственного активного иммунитета: вакцины и анатоксины. 3. Виды вакцин: живые, убитые и химические. 4. Способы приготовления вакцин. 5. Анатоксины нативные и очищенные, их получение и титрован... Читать далее...