Методы культивирования и индикации вирусов

Вирусы составляют обширную группу микроорганизмов, характерными особенностями которых являются ничтожно малые размеры (от 7—8 до 300—350 нм) и облигатный паразитизм. Вирусы способны размножаться только внутри живой клетки и поэтому для их культивирования используют культуры тканей и клеток, развивающийся куриный эмбрион или организм лабораторного животного.

Вирусы вызывают многочисленные заболевания человека, животных и растений, к вирусам относятся и фаги, паразитирующие в бактериальных клетках.

Морфология большинства вирусов может быть изучена только при помощи электронного микроскопа. Оптический микроскоп позволяет изучить морфологию только крупных вирусов после применения специальных методов окраски. При ряде вирусных инфекций в пораженных клетках обнаруживают внутриклеточные включения.

В вирусологии широко пользуются выращиванием вирусов в культурах различных тканей и клеток — культуры фибробластов человека и животных, эмбриональных клеток, клеток злокачественных новообразований и др.

Путем культивирования можно выделять вирусы из организма больного, определять вид или тип выделенного вируса, определять наличие антител в сыворотках больных вирусными инфекциями, размножать вирусы для приготовления профилактических, лечебных и диагностических препаратов.

Для культивирования вирусов может быть использовано два способа получения культуры ткани — метод первичных эксплантатов и метод пассажных культур. Первый метод основан на использовании только первой генерации клеток, т. е. каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани. Значительно шире в вирусологии пользуются методом пассажных культур, при котором культуру ткани поддерживают путем непрерывных перевивок. Методом пассажных культур можно выращивать различные нормальные и опухолевые клетки (культуры HeLa, Hep и др.). Наиболее удобным методом является получение однослойного роста, при котором происходит образование сплошного стелящегося по стенке сосуда слоя клеток. Растущая ткань омывается очень сложной синтетической средой, содержащей все необходимые вещества для жизнедеятельности клеток. Культивирование ткани должно проводиться в строго асептических условиях и для предотвращения загрязнения культуры ткани бактериальной флорой к ней добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин).

Многие вирусы при росте на культуре ткани вызывают цитопатическое действие (ЦПД) — клетки, в которых размножаются вирусы, резко изменяются и затем погибают. В зависимости от вида вируса цитопатическое действие проявляется различно — в виде изменения формы клеток, структуры ядра, цитоплазмы, образования многоядерных клеток — синцитиев или симпластов. Так, например, о размножении вируса полиомиелита в культуре ткани почки обезьяны можно судить по цитопатическому эффекту, а также по цветной пробе. При использовании последнего метода в культуру ткани вносят индикатор (феноловый красный), который изменяет свой цвет при росте нормальной ткани, так как в процессе обмена веществ нормально растущей ткани образуются кислые продукты. При размножении в клетках некоторых вирусов нарушается их нормальный метаболизм и индикатор сохраняет свой первоначальный красный цвет.

Для обнаружения вирусов в клеточных культурах может быть использована реакция гемадсорбции, основанная на свойстве клеток, пораженных некоторыми вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты птиц, животных и человека с образованием на поверхности клеток скоплений эритроцитов в виде разнообразных фигур.

Не менее широко пользуются в вирусологии культивированием вирусов в развивающемся курином эмбрионе. В зависимости от вида вируса берут эмбрионы различного возраста (3 — 13 дней). Заражать эмбрионы можно различно — на хорионаллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную полость или непосредственно в ткань эмбриона (рис.).

Заражение куриного эмбриона

Заражение эмбриона производят в асептических условиях, а вируссодержащий материал должен быть освобожден от бактерий путем добавления антибиотиков.

Размножение вирусов можно получить и в организме экспериментального животного. Так, вирус гриппа размножают в легких белых мышей, вирус энцефалита — в головном мозге мышей и т. д.

На практических занятиях студенты знакомятся с методами культивирования вирусов в культуре ткани, курином эмбрионе и организме лабораторных животных.

Студенты получают культуру куриных фибробластов или клеток HeLa. После изучения культуры клеток под микроскопом (Х8) ее заражают материалом содержащим вирус. Перед заражением культуры ткани из нее при помощи стерильной пастеровской пипетки отсасывают питательную среду, а затем вносят 1 мл вируссодержащего материала, предварительно обработанного антибиотиками. Пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой и в наклонном положении помещают в термостат при температуре 37°С на 5 — 7 сут, после чего пробирки просматривают под малым увеличением микроскопа (Х8). Размножение ряда вирусов сопровождается цитопатическим действием.
 

Для культивирования вирусов в курином эмбрионе чаще пользуются эмбрионами 9 — 11 дней. При заражении на хорионаллантоисную оболочку удаляют небольшой кусочек скорлупы и надрывают подскорлуповую оболочку. После внесения вируссодержащего материала отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого заливают парафином. Зараженных эмбрионов помещают в термостат. При заражении эмбриона вирусом вакцины на хорионаллантоисной оболочке возникают бляшки, видимые невооруженным глазом. При заражении эмбриона в аллантоисную полость исследуемый материал вводят через небольшое отверстие в скорлупе на глубину 2 см, после чего отверстие заливают парафином.

Для выделения и размножения вирусов производят заражение экспериментальных животных. Выбор метода заражения, в известной степени зависит от тропизма вируса. Так респираторными вирусами обычно животных заражают интраназально, для чего наркотизированным животным вируссодержащий материал закапывают в нос. Нейротропными вирусами животных заражают в головной мозг.

Присутствие вируса в культуре ткани, суспензии органов зараженных животных, аллантоисной жидкости куриного эмбриона и др. часто устанавливают по реакции гемагглютинации (РГА) (рис.).

Использование реакции гемагглютинации для определения вируса и антител в сыворотке

Реакция гемагглютинации основана на способности некоторых вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов и, изменяя их поверхность, вызывать гемагглютинацию. Реакцию гемагглютинации можно ставить на стекле и в пробирках. Для постановки реакции гемагглютинации готовят разведения вируссодержащего материала и затем в каждую пробирку добавляют взвесь эритроцитов. Контрольная пробирка не содержит вируссодержащего материала. Пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут. При гемагглютинации образуется зернистый осадок с фестончатыми краями, в контроле осадок должен быть в виде диска с ровными краями.


Практические занятия медицинские биологические препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний

Занятие 1-е. Вакцины и анатоксины.

Вопросы для обсуждения. 1. Искусственный иммунитет, активный и пассивный. 2. Препараты для создания искусственного активного иммунитета: вакцины и анатоксины. 3. Виды вакцин: живые, убитые и химические. 4. Способы приготовления вакцин. 5. Анатоксины нативные и очищенные, их получение и титрован...


Практические занятия вирусы

Занятие 1-е. Методы вирусологических исследований.

Вопросы для обсуждения: 1. Особенности биологии вирусов. 2. Принципы классификации вирусов. 3. Вирион, его строение, размеры и химический состав. 4. Микроскопические методы изучения морфологии вирусов. 5. Методы культивирования вирусов на культурах клеток, куриных эмбрионах, лаб...


Препараты для профилактики и лечения вирусных заболеваний

Препараты для профилактики и лечения оспы. Оспенная вакцина сухая — Vaccinum variolae siccum является живой вакциной. В зависимости от субстрата, на котором культивируют вирус, различают дермальную (культивирование на коже животных), тканевую (культивирование в клеточных культурах) и яичную или ововакцину (культивирование на куриных эмбрионах).

Возбудители основных вирусных заболеваний

Возбудитель оспы. Возбудитель оспы является одним из самых крупных вирусов (200—350 нм). Этот вирус может быть обнаружен в оптическом микроскопе при применении специальных методов окраски (тельца Пашена).

При натуральной оспе в эпителиальных клетках обнаруживаются внутриклеточные включения — тельца Гуарниери.



Категория: Лабораторные занятия по микробиологии
Просмотров: 18 | Теги: методы индикации вирусов, Вирус, вирус микробиология, микробиология вирусы, методы культивирования вирусов, характеристика вирусов | Рейтинг: 0.0/0